LA REVISTA MÉDICA DEL C.I.E.M.

Visualización del Desarrollo Oseo en Fetos Humanos por Técnica Modificada de Dawson

IVAN SANCHEZ SANCHEZ, VICTOR TERREROS VARGAS, JUAN ZEVALLOS GARCIA, JESSICA CARPIO CARI, SAUL SUERO BELTRAME

Estudiantes del Quinto Año de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad Católica Santa María

RESUMEN :

La diafanización por técnica de Dawson permite la visualización in situ de los centros de osificación en embriones y fetos, tiñéndolos con alizarina. La modificación de esta técnica consiste en el uso de xilol como disolvente de grasas y en el de carmín alcohólico como colorante del tejido óseo, en lugar de acetona y alizarina respectivamente, que difícilmente se consiguen en el mercado; como también en el aumento de concentración de KOH para disminuir el tiempo de transparentación. Se emplearon tres fetos humanos de diferentes edades, logrando visualizar con éxito el desarrollo óseo en forma secuenciada y diferenciar la osificación endocondral de la membranosa.

Palabras claves: Diafanización, osificación, técnica de Dawson.

OSSEOUS DEVELOPMENT DISPLAY IN HUMAN FETUSES USING MODIFIED DAWSON´S TECHNIQUE.

SUMMARY :

Transparentation using Dawson´s technique allows in situ display of ossification points in embryos and fetuses, staining them with alizarine. A modification of this technique consists in the use of xilol as a fat solvent, and of alcohol'carmin as an ossious tissue stain, instead of acetone and alizarine, respectively, because the latter products are difficult to get. We also applied a greater KOH concentration to decrease the transparentation time. We employed three human fetuses of different ages, displayed succesfully osseous development in a sequenced manner, and distinguished endocondral from membranous ossification.

Key Words: Transparentation, ossification, Dawson´s technique.

INTRODUCCION

La osificación en el ser humano comienza al final del período embrionario,^1-3 a partir de la sétima semana de vida intrauterina.⁴ Se inicia a partir de centros primarios de osificación, que aparecen en forma secuenciada,^1,3-7 los cuales van evolucionando para llegar a completar el desarrollo óseo en la edad adulta.^5-7 Existen cuatro tipos de osificación: membranosa o directa, endocondral o indirecta, marginal y metaplásica. Los dos primeros tipos son los más frecuentes, los dos últimos son raros.⁸

Es posible visualizar el esqueleto de fetos humanos coloreándolos con alizarina, pudiendo diferenciar la osificación membranosa de la endocondral.^1,3,9 La técnica de Dawson permite la visualización del esqueleto de embriones y fetos, tranparentándolos con KOH, teñido del tejido óseo con alizarina y su conservación final con una solución de glicerina alcohólica. Debido al tiempo prolongado que toma la fase de transparentación, además de la dificultad para obtener los reactivos necesarios; surge la inquietud de modificarla con el fin de salvar estos inconvenientes.

Los objetivos del presente trabajo son: 1) modificar la técnica de Dawson, reduciendo el tiempo de transparentación y reemplazando algunos reactivos por otros más accesibles; 2) visualizar el desarrollo óseo en forma secuenciada y diferenciar la osificación membranosa de la endocondral.

MATERIAL Y METODOS

Se emplearon tres fetos humanos, cuyas edades en semanas oscilaban entre 9 a 12, 13 a 16 y 17 a 20; considerando el índice de vértice a nalga.³ Se trabajó con esta cantidad de fetos debido a la dificultad para conseguirlos. La técnica de Dawson emplea KOH al 1%, esta concentración se elevó al 15% para disminuir el tiempo de transparentación, experimentándose previamente con soluciones al 5, 10, 15 y 20%. Para obtener una tinción adecuada se probaron diferentes concentraciones de carmín alcohólico al 10, 20, y 30%; siendo la óptima la de 20%. Así mismo la acetona se reemplazó por xilol.

* Descripción de la técnica modificada de Dawson: (En cada una de las etapas señaladas a continuación, el embrión o feto debe ser sumergido en la solución indicada, debe retirarse la solución antes del paso siguiente, teniendo en cuenta que el feto debe ser colocado desde el inicio en su recipiente definitivo con el fin de evitar manipulación excesiva que pueda dañar la muestra).

1.-Preparación de la muestra para la transparentación: 1.1)fijación I en alcohol al 95% 1.2)disolución de grasa en xilol 1.3)fijación II en alcohol al 95%. 2.-Diafanización: 2.1)transparentación en KOH al 15% 2.2)el lavado se realiza sustituyendo el KOH por agua destilada cuidadosamente con una jeringa, con el objetivo de retirar el KOH de la muestra, lo que se consigue con el recambio de agua destilada hasta que se vea completamente clara 2.3)deshidratación en alcohol de 50% y de 70% progresivamente. 3.-Tinción: 3.1)coloración en carmín alcohólico al 20% 3.2)aclaramiento para eliminar el exceso de colorante, en una solución de KOH 1%, agua destilada 79% y glicerina 20%. 4.-Conservación: en una solución de alcohol al 95%, ir aumentando la concentración de glicerina, gradualmente de 20, 40, 60 a 80 %, agregando en esta última unos granitos de timol.

* Duración del desarrollo de la técnica modificada de Dawson:

Feto No 01: 09 a 12 semanas. 1.-Preparación:1.1)fijación I: 5 días 1.2)disolución de grasa: 2 días 1.3) fijación II: 5 días. 2.-Diafanización:2.1)transparentación:2 días 2.2)lavado:3 días 2.3)deshidratación alcohol 50%:4 días,alcohol 70%:4 días 3.-Tinción:3.1)coloración:5 días 3.2)aclaramiento:2 días 4.-Conservación:glicerina 20%: 2 días,40%: 3 días,60%: 4 días, 80%: 5 días.

Feto No 02: 13 a 16 semanas. 1.-Preparación:1.1)fijación I: 4 días 1.2)disolución de grasa: 3 días 1.3)fijación II: 4 días 2.-Diafanización:2.1)transparentación:7 días 2.2)lavado:6 días 2.3)deshidratación alcohol 50%:6 días, alcohol 70%:6 días 3.-Tinción:3.1)coloración:7 días 3.2)aclaramiento:4 días 4.-Conservación:glicerina 20%: 4 días, 40%: 5 días, 60%: 6 días, 80%: 7 días.

Feto No 03: 17 a 20 semanas. 1.-Preparación:1.1)fijación I: 4 días 1.2)disolución de grasa: 4 días 1.3)fijación II: 4 días 2.-Diafanización:2.1)transparentación:9 días 2.2)lavado:8 días 2.3)deshidratación alcohol 50%:8 días, alcohol 70%:8 días 3.-Tinción:3.1)coloración:9 días 3.2)aclaramiento:6 días 4.-Conservación:glicerina 20%: 6 días, 40%: 7 días, 60%: 8 días, 80%: 9 días.

RESULTADOS

La técnica modificada de Dawson ha permitido disminuir el tiempo de transparentación, aumentando la concentración de KOH; y reemplazar la alizarina y acetona por carmín alcohólico y xilol respectivamente, los cuales son más accesibles; como también visualizar parte del desarrollo óseo en forma secuenciada y diferenciar la osificación membranosa de la endocondral.

En la tabla No 1 se aprecian los diferentes grados de osificación en que se encuentran los huesos en formación de los tres fetos empleados; como también los tipos de osificación de los mismos.

Se han clasificado los grados de osificación, considerando la extensión de la superficie teñida, de la siguiente manera:

Grado I: la superficie teñida abarca centros primarios de osificación.

Grado II: la superficie teñida abarca menos del 75% de la extensión total del hueso en formación (osificación membranosa) o del molde cartilaginoso (osificación endocondral).

Grado III: la superficie teñida abarca más del 75% de la extensión total del hueso en formación (osificación membranosa) o del molde cartilaginoso (osificación endocondral).

TABLA No 1.- Grados y tipos de osificación.

1.- Este tipo de osificación es marginal, pero se observa como endocondral.

2.- En falange medial de quinto dedo se observa centro de osificación primario.

3.- Este tipo de osificación es metaplásica, pero se observa como endocondral.

4.- En falange medial de segundo dedo se observa centro de osificación primario.

DISCUSION

Para la realización del presente trabajo se han empleado tres fetos, debido a la dificultad en su obtención; pese al número limitado de la muestra se puede visualizar parte del desarrollo óseo en forma secuenciada.

La técnica base de Dawson emplea KOH al 1% para conseguir la transparentación de las muestras, durante un tiempo prolongado (alrededor de un mes); pero en la técnica modificada se incrementó la concentración de KOH al 15%, disminuyendo el tiempo de transparentación (alrededor de una semana), consiguiendo una óptima diafanización sin deteriorar las muestras. Se realizaron las siguentes modificaciones: carmín alcohólico por alizarina como colorante del tejido óseo debido a la dificultad en la obtención de este último colorante; al ser la acetona un producto controlado se optó por utilizar xilol como disolvente de grasas.

Tanto las técnicas que emplean alizarina para teñir el tejido óseo, referidas en la literatura,^1,3,9 como también la técnica modificada de Dawson, permiten la visualización del esqueleto en embriones y fetos, pudiendo diferenciar la osificación membranosa de la endocondral.

En el maxilar inferior, macroscópicamente se aprecia una osificación aparentemente endocondral, que en realidad es marginal. En las falanges distales se aprecia a simple vista una aparente osificación endocondral, cuando es en realidad osificación metaplásica. Estos tipos de osificación, se pueden llegar a diferenciar correctamente al microscopio.⁸

CONCLUSIONES

La técnica modificada de Dawson acorta el tiempo de transparentación y permite reemplazar algunos reactivos por otros más accesibles.

La técnica modificada de Dawson permite observar el esqueleto de fetos humanos (Foto #1). Es óptima para la visualización del desarrollo óseo en forma secuenciada (Foto # 2 y Foto # 3),como también para diferenciar la osificación membranosa de la endocondral (Foto # 2).

RECOMENDACIONES

De acuerdo a los resultados del estudio, es recomendable trabajar con mayor número de fetos humanos con esta técnica, considerando las edades que faltan; para que de esta manera se pueda apreciar el desarrollo óseo en forma secuenciada y completa.

AGRADECIMIENTO

Por su asesoría en la realización de este trabajo a los Doctores:

- Jacinta Torres de Jasaui.

Doctora en Ciencias Biológicas, Embrióloga. Ex-docente da la UNSA. Docente de la UCSM.

- Victor L. Vasquez Huerta.

Médico Cirujano, Parasitólogo. Maestro en Salud Pública con mención en enfermedades infecciosas y tropicales UPCH. Profesor principal de la UNSA. Docente de la UCSM.

BIBLIOGRAFIA

1) Moore Keith L.; Embriología Clínica. Cuarta edición. Interamericana-McGraw-Hill. México. 1988. Pag. 92, 97, 368, 372, 379, 380.

2) Cormack David H.; Histología de Ham. Novena edición. Harla. México. 1987. Pag. 341.

3) Sadler T.W.; Langman Embriología Médica. Quinta edición. Médica Panamericana S.A. Argentina. 1986. Pag. 83, 8, 140, 146.

4) Forfar J., Arneil G.; Textbook of Paediatrics. Tercera edición. Longman group limited. USA. 1984. Vol. 2. Pag.1565-1568.

5) Optiz M., Schmid F.; Enciclopedia Pediátrica. Enfermedades de los tejidos de sostén y enfermedades de sangre y órganos hematopoyéticos. Primera edición. Morata S.A. España. 1970. Pag. 81, 82.

6) Behrman Richard E.; Nelson Tratado de Pediatría. 14^a edición. Interamericana-McGraw-Hill. España. 1992. Pag. 43,44.

7) Meneghello Julio R.; Pediatría. Cuarta edición. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Chile. 1993. Pag. 93,94.

8) Alarcón Jesús W.; Manual de Histología Tomo II. Perú. 1991. Pag. 130-135.

9) Patten Bradley M.; Embriología Humana. Cuarte edición. Ateneo. Argentina. 1969. Pag. 296, 297.

Leyendas de las Fotografías

Foto # 1 : Feto humano de 13 a 16 semanas. Se aprecia claramente el esqueleto, aún en desarrollo; teñido con carmín alcohólico mediante la Técnica Modificada de Dawson.

Foto # 2 : Elementos del esqueleto apendicular y del neurocráneo membranoso de fetos humanos, en los que se diferencia la osificación membranosa de la endocondral. 2a) Segmento de miembro superior de un feto de 17 a 20 semanas y de uno de 13 a 16 semanas, se aprecia el diferente grado de osificación en que se encuentran las estructuras óseas. Dichas estructuras se desarrollan mediante osificación endocondral, obsevándose claramente el molde cartilaginoso transparente y el tejido óseo teñido uniformemente. 2b) Huesos occipital y parietal de un feto humano de 17 a 20 semanas que se desarrollan mediante osificación membranosa, reconocible por la presencia de espículas teñidas que se irradian en forma progresiva a partir de los centros de osificación primaria hacia la periferia.

Foto # 3 : Esqueleto de un feto humano de 13 a 16 semanas y de uno de 17 a 20 semanas, se observa el diferente grado de desarrollo óseo en que se encuentra cada uno, mostrando de esta manera la evolución del proceso de osificación.

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