Optimizan protocolo para detectar  agentes infecciosos en paltos

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Optimizan protocolo para detectar  agentes infecciosos en paltos

El palto (Persea americana Mill.) es una especie frutal de importancia económica, de la cual en especial la variedad Hass tiene una gran demanda mundial por su alto contenido de aceites, carbohidratos, proteínas y vitaminas, así como por la preferencia de sus consumidores, esto ha conllevado a un progresivo incremento de la producción y exportación del mismo en el Perú llevándolo a ser el 8vo país productor a nivel mundial (Forero, García, & Cárdenas-Hernández, 2007; Vidal Gómez, 2010). Dicha demanda generó un incremento de las condiciones competitivas de calidad e inocuidad exigidas generando nuevas normativas de calidad para este clase de producto como las GLOBALGAP y Tesco Nurture`s Choice (Córdoba Vélez et al., 2010).

De entre las enfermedades que afectan a dicho cultivar las provocadas por los viroides Avocado sunblotch viroid (ASBVd) y el Potato spindle tuber viroid (PSTVd) se ha visto que producen un decaimiento en las propiedades organolépticas del fruto, reduciendo y deteriorando su valor comercial, ambos han sido detectados en el Perú por el Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA) y el Centro Internacional de la Papa (CIP) (Barrera & Rojas, 2007; Flores, Daròs, & Hernández, 2000; Querci, Owens, Vargas, & Salazar, 1995).

Dentro de las mejores medidas usadas para el control de enfermedades causadas por viroides están: la prevención de introducción de material infectado (tanto en campos de cultivo así como en invernaderos), el manejo de estrictos procedimientos de higiene y el monitoreo de la aparición de síntomas. Con el desarrollo las técnicas moleculares como la reverse-transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) y su variante la real-time PCR se ha logrado un efectivo manejo y erradicación de viroides como el PSTVd en USA y Canadá (Kovalskaya & Hammond, 2014).

La técnica de Real-time PCR ha sido desarrollada para generar aún mayor sensibilidad y especificidad en sus resultados, sin embargo requiere equipamiento y reactivos especiales que lo hacen costoso (Naidu & Hughes, 2001) (costo que va desde 60 a 70 nuevos soles), por lo cual se busca generar técnicas más baratas y aplicables a escala. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) convencional es una buena alternativa por su menor costo que sólo requiere un RNA total de buena calidad, cDNA y primeros específicos.

Por lo que el presente trabajo busca optimizar la técnica de PCR convencional para detectar los viroides ASBVd y PSTVd presentes en Persea americana Mill var Hass infectadas y obtener así un método más económico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para asegurar la integridad de RNA total se realizaron los respectivos geles de agarosa para verificar la presencia del ARN ribosomal 28 y 18S mientras que para verificar la pureza y concentración de ácidos nucleicos se midió por espectrofotómetro las absorbancias A260 y A280.

Posterior a ello se realizó primero la amplificación por el método One Step RT-PCR y también se llevó a cabo la amplificación de los viroides por el método Two Step

Para realizar el protocolo de detección de los virus PSTVd y ASBVd se necesitó buscar la temperatura óptima de anilamiento del primer específico para detectar la secuencia de los virus, se muestra las temperaturas que se probaron (52, 54, 56, 58, 60 y 62 °C) como se observa el comportamiento en PSTVd y ASBvd es diferencial en PSTVd en la diferentes temperaturas se muestran una sola banda de 360 pares de bases, en cambio en ASBVd se llega a mostrar tres bandas pero dentro del rango indicado para este virus debe presentar la banda de 500 pb (dimérica) y la banda 250 pb (monomérica) esto sirve para su diagnóstico y la temperatura donde se muestra mejor es a la de 52°C, por lo que eligió trabajar con la temperatura de 52°C para ambos virus. Si observamos con PSTVd, a diferentes Tm el resultado es semejante, mientras que ASBVd a 52 ºC se ve una banda más clara.

Hay ventajas de las reacciones One-step, estos incluyen el manejo de muestras limitado y reducido lo que ayuda a disminuir las posibilidades de errores de pipeteo y la contaminación cruzada entre RT y en tiempo real PCR pasos. Por lo general, menos sensibles según BIOLINE  A (2014), es imposible para optimizar las dos reacciones por separado. Con un solo paso la calidad del RNA utilizado en la reacción es muy importante, como todo el cDNA se utiliza para la etapa de PCR posterior, también las condiciones de reacción necesarias para apoyar tanto la RT y PCR pueden no ser óptima, ya sea para la reacción, afectar la eficiencia y el rendimiento. Debido a esto, las reacciones de un solo paso puede requerir mucho más ARN en las muestras iniciales si está realizando múltiples amplificaciones y variación entre estas diferentes reacciones de RT puede complicar la interpretación de ensayo de manera significativa.

La ventaja de two-step está en que se puede optimizar cada paso. Es importante el Tm para lograr una mejor sensibilidad del método, además por este método nos permite encontrar las variantes de los viroides tal como lo indica De la Peña, 2001 ya que estos presentan isoformas, para el ASBVd que se observa dos bandas el viroide la cual no se detectaría la presencia de isoformas.

El costo seleccionando el método de extracción del CTAB modificado así como el two-step, no proporciona un gasto de aproximadamente de 30 nuevos soles por muestra, que viene a ser la mitad del costo de detectar los viroides, con el método de Real-Time

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